檢測精華液蛋白質怎麼做實驗

1. 檢測生物體內糖類,脂肪,蛋白質 所有實驗步驟和注意事項,

一．實驗目的：嘗試用化學試劑檢測生物組織中糖類、脂肪和蛋白質
二．實驗原理：某些化學試劑能使生物組織中的有關有機化合物,產生特定的顏色反應.
1．可溶性還原糖（如葡萄糖、果糖、麥芽糖）與斐林試劑發生作用,可生成磚紅色的Cu 2O沉澱.即Cu ( OH ) 2被還原成Cu 2O,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸.
2．脂肪可以被蘇丹Ⅲ染液染成橘黃色（或被蘇丹Ⅳ染液染成紅色）.
3．蛋白質與雙縮脲試劑發生作用,產生紫色反應.（蛋白質分子中含有很多肽鍵,在鹼性NaOH溶液中能與雙縮脲試劑中的Cu2+作用,產生紫色反應.）
4.澱粉遇碘變藍色.
三．實驗材料
1．做可溶性還原性糖鑒定實驗,應選含糖高,顏色為白色的植物組織,如蘋果、梨.（因為組織的顏色較淺,易於觀察.）
2．做脂肪的鑒定實驗.應選富含脂肪的種子,以花生種子為最好,實驗前一般要浸泡3-4小時（也可用蓖麻種子）.
3．做蛋白質的鑒定實驗,可用富含蛋白質的黃豆或雞蛋清.
四、實驗試劑
斐林試劑（包括甲液：質量濃度為0.1g/ mL NaOH溶液和乙液：質量濃度為0.05g/ mL CuSO4溶液）、蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液、雙縮脲試劑（包括A液：質量濃度為0.1g/ mL NaOH溶液和B液：質量濃度為0.01g/ mL CuSO4溶液）、體積分數為50%的酒精溶液,碘液、蒸餾水.
五、方法步驟：
（一） 可溶性糖的鑒定
操 作 方 法
注 意 問 題
解 釋
1.制備組織樣液.
（≠組織液、≠細胞液）
蘋果或梨組織液必須臨時制備
因蘋果多酚氧化酶含量高,組織液很易被氧化成褐色,
將產生的顏色掩蓋.
2.注入2mL組織樣液.
3.注入1mL新制的斐林試劑,振盪.
（現配現用、先混後加）
應將組成斐林試劑的甲液、乙液分別配製、儲存,使用前才將甲、
乙液等量混勻成斐林試劑；切勿將甲液、乙液分別加入蘋果組織樣液中進行檢測.
斐林試劑很不穩定,甲、乙液混合保存時,生成的Cu ( OH ) 2在70-900C下分解成黑色CuO和水；甲、乙液分別加入時可能會與組織樣液發生反應,無
Cu ( OH ) 2生成.
4.水浴加熱：試管放在盛有50-650C溫水的大燒杯中,加熱約2分鍾,觀察到溶液顏色：淺藍色 → 棕色 → 磚紅色（沉澱）
最好用試管夾夾住試管上部,使試管底部不觸及燒杯底部,試管口不朝向實驗者.
也可用酒精燈對試管直接加熱.
防止試管內的溶液沖出試管,造成燙傷；
縮短實驗時間.
（二）脂肪的鑒定
操 作 方 法
注 意 問 題
解 釋
取材、切片、製片：花生種子浸泡、去皮、切下一些子葉薄片,將薄片放在載玻片的水滴中,用吸水紙吸去裝片中的水.
干種子要浸泡3-4小時,新花生的浸泡時間可縮短.
浸泡時間短,不易切片,浸泡時間過長,組織較軟,切下的薄片不易成形.切片要盡可能薄些,便於觀察.
染色：在子葉薄片上滴2-3滴蘇丹Ⅲ（染色3分鍾）或蘇丹Ⅳ染液（染色1分鍾）.
染色時間不宜過長.
漂洗：用吸水紙吸去薄片周圍染液,用50%酒精洗去浮色,吸去酒精.
酒精用於洗去浮色,不洗去浮色,會影響對橘黃色脂肪滴的觀察.同時,酒精是脂溶性溶劑,可將花生細胞中的脂肪顆粒溶解成油滴.
用吸水紙吸去薄片周圍酒精,滴上1-2滴蒸餾水,蓋上蓋玻片.
滴上清水可防止蓋蓋玻片時產生氣泡.
鏡檢：先低後高（高倍鏡用法：移物換器時針反）,低倍鏡下找到花生子葉薄片的最薄處,可看到細胞中有染成橘黃色或紅色圓形小顆粒.
裝片不宜久放.
時間一長,油滴會溶解在乙醇中.
三、蛋白質的鑒定
操 作 方 法
注 意 問 題
解 釋
制備組織樣液.
（浸泡、去皮研磨、過濾.）
黃豆浸泡1至2天,容易研磨成漿,
也可購新鮮豆漿以節約實驗時間.
加樣液約2ml於試管中,
加入雙縮脲試劑A,搖勻；再加入雙縮脲試劑B液3-4滴,搖勻,溶液變紫色.
A液和B液也要分開配製,儲存.鑒定時先加A液後加B液.
CuSO4溶液不能多加.
先加NaOH溶液,為Cu2+與蛋白質反應提
供一個鹼性的環境.A、B液混裝或同時加入,會導致Cu2+變成Cu ( OH ) 2沉澱,而失效.
否則CuSO4藍色會遮蓋反應的真實顏色.
可用蛋清代替豆漿.
蛋清要先稀釋.
如果稀釋不夠,在實驗中蛋清粘在試管壁,與雙縮脲試劑反應後會粘固在試管內
壁上,使反應不容易徹底,並且試管也不易洗干凈.
附：澱粉的檢測和觀察用試管取2ml待測組織樣液,向試管內滴加2滴碘液,觀察顏色變化.
碘液不要滴太多
以免影響顏色觀察

2. 高中生物必修一檢測蛋白質的實驗

folin—酚試劑法。

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。

folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

(2)檢測精華液蛋白質怎麼做實驗擴展閱讀：

注意事項：

樣品應是均勻的，若是固體樣品應事先研細過篩，液體樣要混合均勻。

樣品放入凱氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。

如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對於縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱。這時由於分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。

3. 蛋白質檢驗實驗步驟,要具體,清楚的,只要蛋白質

1.先取樣本液體用試管裝著
2.配置好A液和B液
3.先加入A液,再加入B液
4.如果溶液變紫色,則含有蛋白質

4. 「蛋白質的鑒定」實驗怎麼做

鑒定蛋白質有多種方法
1，在待測液中加入雙縮脲試劑並水浴加熱有紫色物質生成
2，在待測液中加入稀硝酸並加熱變為淡黃色3，若為固體，則放到酒精燈上加熱，可以聞到燒焦的羽毛氣味

5. 做化學實驗時,如何檢測蛋白質存在

蛋白質的顏色反應
1．黃蛋白反應
於試管中，加1mL蛋白質溶液和10滴濃硝酸溶液，直火加熱煮沸，觀察溶液和沉澱顏色。冷卻後，再加入20滴10%氫氯化鈉溶液，觀察顏色變化。
2．與茚三酮的反應
在二支試管中，分別加1%賴氨酸溶液和1mL蛋白質溶液，分別加2滴茚三酮溶液，加熱至沸，觀察有什麼現象？
3．與硝酸汞試劑作用——米倫反應
在二支試管中，分別加1mL 0.5%苯酚溶液和1mL蛋白質溶液，再各加0.5mL米倫試劑（不可太多），苯酚溶液出現玫瑰紅色，而蛋白質溶液加熱後出現沉澱，加熱凝固的蛋白質呈磚紅色，有時溶液也呈紅色。
4．蛋白質的雙縮脲反應
(1) 雙縮脲的生成
於乾燥試管中，加0.2g～0.3g尿素，微火加熱，尿素熔化並形成雙縮脲，放出的氨可用紅色石蕊試紙試驗。試管內有白色固體出現後，停止加熱。
(2) 雙縮脲反應
上述產物冷卻後，加1mL10%氫氧化鈉溶液，搖勻，再加2滴2%硫酸酮溶液，混勻，觀察有無紫色出現。
於試管中，加1mL清蛋白溶液和1mL10%氫氧化銅溶液，再加1滴～2滴2%硫酸銅溶液共熱，由於蛋白質與硫酸銅生成絡合物而呈紫色。取1%賴氨酸溶液作對照，觀察顏色變化。
注:米倫試劑是硝酸、亞硝酸、硝酸汞及亞硝酸汞之混合物，能與苯酚及某些酚類起顏色反應。

6. 蛋白質鑒定實驗

實驗一 生物組織中脂肪,蛋白質的鑒定
一,實驗原理
(1)鑒定實驗設計的理念:
某些化學試劑 + 生物組織中有關有機化合物 產生特定的顏色反應.
(2)具體原理:
1、脂肪小顆粒 + 蘇丹Ⅲ染液→橘黃色小顆粒.
2、蛋白質 + 雙縮脲試劑→紫色反應.
二,目標要求
初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
三,重點,難點
1.重點
①初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
②通過實驗的操作和設計培養學生的動手能力,掌握探索實驗設計技巧,從而培養創新思維能力.
2.難點
根據此實驗方法,原理,設計實驗來鑒定常見食物的成分.
四,實驗材料
1.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
2.蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白).
五,儀器,試劑
1.儀器:剪刀,解剖刀,雙面刀片,試管,試管架,試管夾,大小燒杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精燈,三腳架,石棉網,火柴,研缽,石英砂,紗布,載玻片,蓋玻片,毛筆,吸水紙,顯微鏡.
2.試劑：1蘇丹Ⅲ染液;2雙縮脲試劑;3 體積分數為50%的酒精溶液;4蒸餾水.
六,方法步驟
（1）脂肪的鑒定
脂肪的鑒定步驟:
取材:花生種子(浸泡3-4h),將子葉削成薄...實驗一 生物組織中脂肪,蛋白質的鑒定
一,實驗原理
(1)鑒定實驗設計的理念:
某些化學試劑 + 生物組織中有關有機化合物 產生特定的顏色反應.
(2)具體原理:
1、脂肪小顆粒 + 蘇丹Ⅲ染液→橘黃色小顆粒.
2、蛋白質 + 雙縮脲試劑→紫色反應.
二,目標要求
初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
三,重點,難點
1.重點
①初步掌握鑒定生物組織中脂肪,蛋白質的基本方法.
②通過實驗的操作和設計培養學生的動手能力,掌握探索實驗設計技巧,從而培養創新思維能力.
2.難點
根據此實驗方法,原理,設計實驗來鑒定常見食物的成分.
四,實驗材料
1.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
2.蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白).
五,儀器,試劑
1.儀器:剪刀,解剖刀,雙面刀片,試管,試管架,試管夾,大小燒杯,小量筒,滴管,玻璃漏斗,酒精燈,三腳架,石棉網,火柴,研缽,石英砂,紗布,載玻片,蓋玻片,毛筆,吸水紙,顯微鏡.
2.試劑：1蘇丹Ⅲ染液;2雙縮脲試劑;3 體積分數為50%的酒精溶液;4蒸餾水.
六,方法步驟
（1）脂肪的鑒定
脂肪的鑒定步驟:
取材:花生種子(浸泡3-4h),將子葉削成薄片
取理想薄片
在薄片上滴2-3滴蘇丹Ⅲ染液
去浮色
製成臨時裝片
觀察:先在低倍鏡下,找到材料的脂肪滴,然後,轉為高倍鏡觀察.
結論:細胞中的圓形脂肪小顆粒已經被染成橘黃色.
實驗成功的要點:
①.脂肪的鑒定實驗:選擇富含脂肪的種子,以花生種子為最好(實驗前浸泡3h～4h).
②該試驗成功的關鍵是獲得只含有單層細胞理想薄片.
③滴蘇丹Ⅲ染液染液染色2-3min,時間不宜過長,以防細胞的其他部分被染色.
（2）蛋白質的鑒定
蛋白質的鑒定步驟:
選材:卵清稀釋液或黃豆(浸泡1-2d) 豆漿 濾液

結論:蛋白質與雙縮脲試劑發生紫色反應.
2,實驗成功的要點:
①蛋白質的鑒定實驗:可用浸泡1d～2d的黃豆種子(或用豆漿,或用雞蛋蛋白稀釋液).
②雙縮脲試劑的使用,一定要先加入A液(即0.1 g/ml的 NaOH 溶液),再加入雙縮脲試劑B液(即0.01 g/ml的 CuSO4 溶液).
③還可設計一隻加底物的試管,不加雙縮脲試劑,進行空白對照,說明顏色反應的引起是蛋白質的存在與雙縮脲試劑發生反應,而不是空氣的氧化引起.

7. 科學小實驗――蛋白質檢測怎麼做

檢測蛋白質可以用最簡單的辦法就是雙縮脲試劑。具體的說就是需要用0.1克每毫升的氫氧化鈉和0.01克每毫升的硫酸銅溶液。在使用的時候需要先加氫氧化鈉1ml。然後再滴入三到四滴硫酸銅溶液。最後在不加熱的情況下會觀察到蛋白質顯現出紫顏色，由此可以證明蛋白質的存在。

8. 蛋白質檢驗實驗步驟

選擇高蛋白的食物漿液，比如豆漿和蛋清。然後准備檢測蛋白質的雙縮脲試劑，由A液和B液組成，A液：氫氧化鈉的質量分數為0.1 g/mL的水溶液。B液：硫酸銅的質量分數為0.01 g/mL的水溶液。

在實驗時，需要現在待測液體中先在加入A液，先製造出鹼性環境，滿足B液與蛋白質反應的條件，這樣才可以方便進行蛋白質的檢測。一段時間後，如果試管中的液體變為紫色，說明待測液體中含有蛋白質，而且顏色深淺與蛋白質濃度成正比。

(8)檢測精華液蛋白質怎麼做實驗擴展閱讀：

蛋白質檢驗注意事項：

用戶需要注意樣品應是均勻的，若是固體樣品應事先研細過篩，液體樣要混合均勻。

樣品放入凱氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。

如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對於縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

9. 檢驗蛋白質的方法及現象

在鹼性溶液中，雙縮脲試劑能與蛋白質反應，形成紅褐色絡合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比．因此，檢驗蛋白質可用滴加雙縮脲變成紅褐色的方法，出現的現象是紅褐色．
故選B

10. 如何准確測定樣品中蛋白質的含量

5種方法測定蛋白質含量

一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強鹼鹼化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。

二、雙縮脲法（biuret法）

1、實驗原理

雙縮脲是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。

2、試劑與器材

（1）試劑：a、標准蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白或標准酪蛋白，配製成10mg/ml的標准蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。

如有需要，標准蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配製成標准蛋白質溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配製，酪蛋白用0.05n nach配製。

b、雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅和6.0克酒石酸鉀鈉，用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀釋到1升，貯存於塑料瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製。

（2）器材： 可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

3、操作方法

（1）標准曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標准蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然後加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻後，在室溫（20～25℃）下放置30分鍾，於540nm處進行比色測定。

用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標准曲線。

（2）樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

三、folin—酚試劑法（lowry法）

1、實驗原理

這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。

這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。

在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。 folin—酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標准曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。

對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。

濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。

含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。

進行測定時，加folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定，但上述還原反應只在ph=10的情況下發生，故當folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。

此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。 此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

2、試劑與器材

（1）試劑

a、試劑甲： （a）10克碳酸鈉，2克 naoh和0.25克酒石酸鉀鈉 。溶解於500毫升蒸餾水中。 （b）0.5克硫酸銅溶解於100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。

b、試劑乙：在2升磨口迴流瓶中，加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上迴流管，以小火迴流10小時，迴流結束時，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數滴液體溴，

開口繼續沸騰15分鍾，以便驅除過量的溴。冷卻後溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置於棕色試劑瓶中保存。使用時用標准nach滴定，酚酞作指示劑，然後適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1n左右。

c、標准蛋白質溶液: 精確稱取結晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶於蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶於水若混濁，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可見光分光光度計

b、旋渦混合器

c、秒錶

d、試管16支

3、操作方法

（1）標准曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標准蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，

然後每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，於室溫（20～25℃）放置10分鍾。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑），同樣立即混勻。

這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然後在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標准曲線。

注意：因lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲後，開始計時，1分鍾後，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鍾後加第3支試管，余此類推。

全部試管加完試劑甲後若已超過10分鍾，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鍾後第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鍾後加第3支試管，余此類推。待最後一支試管加完試劑後，再放置30分鍾，然後開始測定光吸收。

每分鍾測一個樣品。 進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），並按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。

folin—酚試劑法實驗表 管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標准蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白質 0.2 0.4 0.6 （約250mg/ml）

蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白質的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。

通常樣品的測定也可與標准曲線的測定放在一起，同時進行。即在標准曲線測定的各試管後面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。

根據所測樣品的吸光度值，在標准曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。

注意:由於各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用於測定蛋白質的相對濃度（相對於標准蛋白質）。

四、改良的簡易folin—酚試劑法

1、試劑

（1）試劑甲：鹼性銅試劑溶液中，含0.5n 氯化鈉、10%碳酸鈉、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配製時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解後，最後加入。

（2）試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。

（3）標准蛋白質溶液：同基本法。

2、操作步驟 測定標准曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鍾後，試劑乙改為4毫升。在55℃恆溫水浴中保溫5分鍾。

用流動水冷卻後，在660nm下測定其吸光度值。 改良的快速簡易法，可獲得與 folin—酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結果。

五、考馬斯亮蘭法（bradford法）

1、實驗原理 雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。

1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。

這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。 考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。

經研究認為，染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。 在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質濃度成正比。

2、試劑與器材

（1）試劑：

a、標准蛋白質溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配製成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標准蛋白質溶液。

b、考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250，溶於50ml 95%的乙醇後，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。

（2）器材：

a、可見光分光光度計

b、旋渦混合器

c、試管16支

3、操作方法

（1）標准方法

a、取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標准蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然後用無離子水補充到0.1ml。

最後各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難於消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。

b、加完試劑2-5分鍾後，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1ml水加5.0mg—250試劑。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用後立即用少量95%的乙醇盪洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。

考馬斯亮蘭法實驗表管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標准蛋白質 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白質 0.02 0.04 0.06 (約1.0mg/ml)

蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考馬斯亮藍 g－250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白質量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用標准蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值a595為縱座標，作圖，即得到一條標准曲線。由此標准曲線，根據測出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。

（2）微量法 當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml水，考馬斯亮藍g－250試劑仍加5.0ml，同時作相應的標准曲線，測定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。