鼠尾胶原怎么成胶

⑴ 求助 细胞复苏后不活怎么回事

细胞复苏后不活怎么回事

齐氏生物认为复苏细胞是否贴壁跟你冻存时的操作有直接关系。而且细胞的传代数越多，即细胞越老，越禁不起低温的折腾。复苏后，细胞有个休眠期，大约7-14天不等。只要不死，你就慢慢养着。突破了某个时间点，你会发现细胞又神奇的康复了。但要等到细胞状态良好，传2代以上再做实验。尤其是流式、RNA干扰之类的。

1. 细胞不好贴壁，细胞生物学专家CHI scientific 建议您尝试以下6点：

2. 复苏后洗涤一下,毕竟DMSO影响细胞的生长。

3. 最好用塑料瓶培养,如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶,或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻,效果应该还可以，或者涂 fibronectin/collagen /BSA，也可以帮助细胞贴附

还有就是你的冻存的细胞是否是完全死了,如果是的话是不可能贴壁的,因此在复苏后我建议你用台盼兰染色看一下死细胞和活细胞的数目及比例.

4.换液时间延长，尽量不要用力摇动。

5.尽量缩短复苏时间

6.操作的环境温度最好不要变动太多。

⑵ 求细胞迁移实验步骤（Transwell或细胞划痕法都可以）

细胞迁移实验步骤（Neuroprobe的使用方法）

1．膜预处理
将48.5ml H2O +1.5ml 醋酸+150μL 鼠尾胶原置于50ml的离心管。在膜的粗糙面用铅笔做标记，放入上述溶液中4度过夜。
实验前将膜取出，放入装有PBS的培养皿中漂洗一遍，再用饥饿培养基洗一遍，吸去培养基后加入新的饥饿培养基，放入37度培养箱中。
2. 处理细胞
将细胞消化，调浓度1×105个/ml，细胞迁移装置下层加入166μl含有刺激因子的饥饿培养基。小心铺好膜（粗面朝下），装好塑料垫，固定上层装置。上层加入100μl细胞悬液，迁移4-6h。
3. 固定
小心将膜取下来，在用PBS弄湿的滤纸上挂掉光滑面的细胞，在新的滤纸上粗面朝上放置，彻底晾干。然后再甲醇里粗面朝上固定5min，彻底晾干。
4. 染色
粗面朝下置于结晶紫染液中30min，取出膜用双蒸水漂洗一遍，粗面朝上放在载玻片上，数细胞。
这个方法比transwell方便。与boyden chemper法类似。

Transwell法的步骤：
先把小室擦干净后在超净工作台照紫外过夜。如新的小室省略此步。下一步将小室倒扣并小室的底部外侧滴加0.1%（还是1%记不清了）的明胶室温放置20-30分钟。这是将细胞消化下来，调浓度。拿出24孔板加600ml的含有刺激因子的培养基。小室上还未干的明胶甩掉，加细胞放入24孔板里。放入细胞培养箱培养4-6小室。拿出小室甩掉里边的培养基。小心擦尽小室里边的细胞（不能碰外边）。将小室放入装有600ml结晶紫的24孔板染色1小时。移到空的24孔板后即可在显微镜下观察了。

⑶ huh7与和hepg2两个细胞系的区别

huh7与和hepg2两个细胞系的区别主要是：

1、来源不同

Huh7人肝癌细胞系是由Naka bayashi等人建立的，细胞源自一个日本男性高分化肝细胞肝癌；

HepG2来源于高加索地区一个15岁白人的肝癌组织。

2、类型不同

Huh7人肝癌细胞系是高分化肝细胞肝癌；

HepG2组织类型为肝母细胞瘤。

3、分泌物不同

Huh7人肝癌细胞系能产生一些细胞质蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶、AFP等。

HepG2细胞系可分泌ALB、a2-MG等，适合用于肝细胞代谢方面的研究。

(3)鼠尾胶原怎么成胶扩展阅读：

肿瘤细胞培养技术要点

1、取材

材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

2、成纤维细胞排除

在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率

根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

⑷ 原代肝细胞培养问题

原代肝细胞很容易贴壁生长，4小时肯定能贴壁。

“然后就有浑浊的沉淀，那个沉淀是肝细胞吧？”将此沉淀用培养液或pbs稀释，加台盘蓝染色，显微镜下观察，若为活细胞，通常就是肝细胞了，要培养好，最好有大于85%以上的活性。

原代肝细胞最好生长在鼠尾胶原上，也就是用鼠尾胶原铺板，然后再普细胞。

4小时后换液，然后每20小时左右换液，通常原代肝细胞难以增值，但是维持20天左右没问题。

⑸ 鼠尾胶原蛋白I型，用那一种胶原酶可以溶解

醋酸就可以.

1．将胶原加入到0.1M 的醋酸中，制备成浓度为0.1%的溶液。在室温中搅拌1-3小时直到完全溶解。

2．建议将溶液转移到拧口的玻璃瓶中，并小心的在瓶底铺上一层氯仿。氯仿的量约为胶原溶液的10%。不要晃动或搅拌。在2-8度中放置过夜。在无菌条件下转移上层的胶原溶液。我们不建议用过滤的方法无菌化。已经发现该方法会导致丢失蛋白。

3．稀释一定数量的胶原溶液。

4．按照6-10ug/cm2的浓度包被培养瓶。在室温或37度结合数小时或者2-8度过夜。

5．从包被表面除去多余的液体。过夜干燥。如果胶原溶液不是无菌的，这时候可以在无菌细胞操作室中暴光在紫外线下过夜消毒。 在接种细胞前用无菌的水漂洗。

⑹ 细胞系的建株要点

肿瘤细胞培养技术要点
1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。
2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率
根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

⑺ transwell细胞成团怎么回事

染色
粗面朝下置于结晶紫染液中30min。小心铺好膜（粗面朝下）。
4。然后再甲醇里粗面朝上固定5min，彻底晾干，在新的滤纸上粗面朝上放置，彻底晾干。拿出小室甩掉里边的培养基。小心擦尽小室里边的细胞（不能碰外边）细胞迁移实验步骤（Neuroprobe的使用方法）

1．膜预处理
将48.5ml H2O +1。移到空的24孔板后即可在显微镜下观察了.5ml 醋酸+150μL 鼠尾胶原置于50ml的离心管，装好塑料垫. 固定
小心将膜取下来。这是将细胞消化下来。将小室放入装有600ml结晶紫的24孔板染色1小时，调浓度。拿出24孔板加600ml的含有刺激因子的培养基。
3，加细胞放入24孔板里。放入细胞培养箱培养4-6小室。在膜的粗糙面用铅笔做标记，放入上述溶液中4度过夜。
实验前将膜取出，放入装有PBS的培养皿中漂洗一遍，再用饥饿培养基洗一遍，吸去培养基后加入新的饥饿培养基，放入37度培养箱中。
2. 处理细胞
将细胞消化，调浓度1×105个/ml。与boyden chemper法类似。

Transwell法的步骤：
先把小室擦干净后在超净工作台照紫外过夜。如新的小室省略此步。下一步将小室倒扣并小室的底部外侧滴加0.1%（还是1%记不清了）的明胶室温放置20-30分钟，细胞迁移装置下层加入166μl含有刺激因子的饥饿培养基，粗面朝上放在载玻片上，数细胞。
这个方法比transwell方便，取出膜用双蒸水漂洗一遍，固定上层装置。上层加入100μl细胞悬液，迁移4-6h。小室上还未干的明胶甩掉，在用PBS弄湿的滤纸上挂掉光滑面的细胞

⑻ 有哪位高手能详细指导一下用transwell板做细胞趋化实验的具体方法和步骤吗

1
材料与方法
1.
1
Matrigel：Becton
Dickinson
Compary,
-
20
℃保存；
Tanswell
plate：Costar
,USA
,
#
3422
,聚碳酯膜微孔直径为8μm；
苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1.
2
趋化因子的制备
取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次;
加入无血清培养基,37℃,5
%CO2
培养24
h～48h，收集细胞培养上清；4
℃,12
000rpm
离心,10
min
,取上清；0.22
μm
滤膜过滤除菌；分装,在-
20
℃保存。
1.
3
transwell
培养板准备
所有操作均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel
在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl
Matrigel
加入冰预冷的300μl
无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel
25
μl
加入transwell
板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37
℃,30
min
,使Matrigel
聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell
培养板置于37℃可保存2
周。
1.
4
Matrigel
侵袭实验(Matrigel
Invasion
Assay)刺激后的各组细胞用PBS
漂洗3
次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5
×105个细胞/
ml
,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95
%。Transwell
培养板上室加入100μl
细胞悬液(
5
×104
个)
并加入无血清培养基200
ul
。Transwell
培养板下室加入500μl
趋化因子,37℃,5
%CO2
培养24
h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel
凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30
min。苏木素染色1
min。梯度乙醇脱水(80
%
,95
%
,100
%)
,二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下(
×400)
随机取6
个视野[1
]
计数,取平均数。重复实验两次。
注意
2.
1
NIH3T3
细胞制备的趋化因子与胎牛血清
趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2
]
。目前利用NIH3T3
细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810
胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3
细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3
T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1
周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2
d
,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3
细胞制备的趋化因子。
2.
2
细胞的准备
所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95
%。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。
2.
3
擦去Matrigel
凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞
先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat
rigel
凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。
2.
4
苏木素染色
上室浸泡在新苏木素中的时间为1
min
,用过多次的苏木素为2
min。在研究粉防己碱对HUVEC
人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚(见图1)
。在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810
胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚(见图2)
。

⑼ 求助原代肝细胞培养问题

原代肝细胞很容易贴壁生长,4小时肯定能贴壁.
“然后就有浑浊的沉淀,那个沉淀是肝细胞吧?”将此沉淀用培养液或pbs稀释,加台盘蓝染色,显微镜下观察,若为活细胞,通常就是肝细胞了,要培养好,最好有大于85%以上的活性.
原代肝细胞最好生长在鼠尾胶原上,也就是用鼠尾胶原铺板,然后再普细胞.
4小时后换液,然后每20小时左右换液,通常原代肝细胞难以增值,但是维持20天左右没问题.

⑽ 复苏的细胞为什么不贴壁

齐氏生物认为复苏细胞是否贴壁跟你冻存时的操作有直接关系。而且细胞的传代数越多，即细胞越老，越禁不起低温的折腾。复苏后，细胞有个休眠期，大约7-14天不等。只要不死，你就慢慢养着。突破了某个时间点，你会发现细胞又神奇的康复了。但要等到细胞状态良好，传2代以上再做实验。尤其是流式、RNA干扰之类的。
细胞不好贴壁，细胞生物学专家CHI
scientific
建议您尝试以下6点：
复苏后洗涤一下,毕竟DMSO影响细胞的生长。
最好用塑料瓶培养,如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶,或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻,效果应该还可以，或者涂
fibronectin/collagen
/BSA，也可以帮助细胞贴附

还有就是你的冻存的细胞是否是完全死了,如果是的话是不可能贴壁的,因此在复苏后我建议你用台盼兰染色看一下死细胞和活细胞的数目及比例.

4.换液时间延长，尽量不要用力摇动。
5.尽量缩短复苏时间
6.操作的环境温度最好不要变动太多。

希望能帮到你！