2型膠原酶怎麼終止消化

① 幹細胞消化傳代要注意哪些問題

一、貼壁細胞的消化 :
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶 這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶 這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。

胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同CMF或PBS加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入PBS緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。

在此介紹一種簡單省事並且效果好、不損失幹細胞的方法：倒掉舊培養液，加入少量胰酶沖洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入適量新培養基中和並分瓶。

這里，胰酶消化的程度是一個關鍵：消化過度則對幹細胞的活性損傷較大，並有部分幹細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則幹細胞難於從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷幹細胞活性。 影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配製條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍後存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。
2、離子螯合劑
離子螯合劑：不破壞細胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測幹細胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。
1）、EDTA 用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用於細胞與間質，對細胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱鹼性條件下才易溶。因此，配製時應調節好酸鹼度，它不能被中和。因此，消化下來的幹細胞要洗一遍。
2）、商品化的無酶消化液 有些消化酶液對幹細胞的損傷比較大，但是分離成單細胞懸液的能力確實比較強。

對於較難消化的幹細胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鍾，然後再棄去，加培養基吹打。或者是棄去培養液後，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄去大部分EDTA，加入與剩餘EDTA等量的胰酶（預熱）總體積1/10v。消化到有幹細胞脫落。但大量使用EDTA對幹細胞有損傷作用。也可以先用PBS把幹細胞洗兩遍，使瓶內沒有血清了，減少對胰酶的中和，然後用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然後可以在少量幹細胞消化下來時，拿著瓶口，運用手腕的力量輕輕震盪瓶內液體，這樣幹細胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻。
3、物理法：直接吹打或用細胞刮子將幹細胞刮下來。
4、冷凍法：
此方法僅能用於細胞傳代時無法使組織上的細胞脫落下來的情況。本方法的原理是因幹細胞冷凍後收縮，從而從培養瓶上脫落下來。優點是：對幹細胞損傷小，不需要中止或洗幹細胞，方便，不需要另外配製消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的幹細胞。不足是幹細胞常成小片脫落。此種方法曾用於因用其它方法傳代導致大量細胞死亡操作的間充質幹細胞、DC細胞的培養，效果非常滿意。具體過程是：1）、用較多的4度的PBS洗滌一遍細胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作台上，很快細胞就小片脫落，3）、輕輕吹打，細胞即完全脫落，4）、按一定比例傳代。
消化時間和幹細胞類型、消化液的消化能力、幹細胞的密度等多種因素有關。幹細胞消化過程要注意消化時間。一般養一種新的幹細胞要摸索一下消化時間，掌握幹細胞消化到什麼程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強，配好後可分裝成小管，一次用完，其餘凍在－20℃，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可，可放入培養箱中，因外在37℃時酶的活力高於常溫，有利於縮短消化時間。還有一種方法，就是將胰酶鋪滿瓶底後，輕搖培養瓶，使胰酶與幹細胞充分解除，然後倒掉大部分胰酶，利用剩餘的少量胰酶再消化一段時間，待幹細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可。細胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好，若幹細胞密度過大則消化後幹細胞易成團。

消化時間不應超過5分鍾，否則對幹細胞損害很大。消化液覆蓋幹細胞，成一薄膜，然後反復傾斜，使消化液沖刷幹細胞，當幹細胞收縮，部分幹細胞脫落時，可用完全培養基馬上中和，同時吹打壁上幹細胞。
在消化過程中經常出現細胞鋪不開的問題，原因有二：一是消化時離心管中的細胞沒有吹打開，解決方法是離心後的細胞加3ml左右的培養基，用吸管輕輕吹打，吹打開後，再加培養基，這樣細胞不會成團，培養基太多，細胞不容易吹打開。二是接種時，培養瓶中先加培養基，再接種細胞，接種後輕輕晃動搖勻。先加細胞後加培養基或不晃動搖勻，其結果就是細胞鋪不開。

二、 貼壁幹細胞的傳代擴增
貼壁幹細胞在培養瓶長成緻密單層後，繼續生長的空間不足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養，對幹細胞進行傳代擴增。
對於貼壁不太緊的細胞，可以直接吹散後分瓶。而對於貼壁較緊的幹細胞如CHO，則需要以胰酶消化後再吹散分瓶，一般過程為：
• 將長成緻密單層幹細胞的細胞瓶中原來的培養液棄去；
• 加入0.25％胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤；
• 一般消化時間約為1至3分鍾，肉眼觀察瓶壁半透明的細胞層，當見到出現細針孔空隙時，棄去胰酶溶液，並加入適量的細胞培養液終止消化；
• 視實驗要求分入多瓶繼續培養，一般為一傳二到一傳四的比例。

傳代細胞培養注意事項：
1.嚴格的無菌操作 .
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配製時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養幹細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變鬆散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

② 膠原酶在4度冰箱放了一個月會失活嗎

膠原酶4度存放，最好1~2周內用完；
長時間貯存宜在-20攝氏度，用前可放37度溶解，但溶解時間不能過久，防止酶活性受影響；
消化組織時間：取決於消化液濃度和組織類型，一般消化時間為2－3小時或者4度過夜。

③ Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶有什麼區別

膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。
膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

④ 膠原酶 消化，膠原酶 消化效果怎麼樣

膠原蛋白水解酶消化比胰蛋白酶時間長2－3倍左右，效果不錯。

⑤ 什麼是膠原酶消化法

就是用膠原酶處理消化組織達到分離細胞的目的，所用膠原酶有不同類型：
1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細胞，用於哺乳動細胞的分離。
2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。
3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。
4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織

⑥ 細胞培養瓶培養的癌細胞多少天凋亡

首先，衰老的腫瘤細胞盡管不能增殖，但它們仍保留著代謝活力，可產生具有抑制和促進腫瘤生長活性的蛋白質，能夠以旁分泌的形式影響鄰近腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤生長。其次，衰老細胞往往具有凋亡抗性，能夠通過過度表達Bcl一2而抵抗凋亡，故不容易清除而在人體長期存活。
腫瘤細胞在組織培養中佔有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌葯檢測、癌分子生物學極其重要的手段。腫瘤細胞培養對闡明和解決癌症將起著不可估量的作用。
一、組織培養腫瘤細胞生物學特性
腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞，其差異較小，但也並非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點：
（－）形態和性狀
培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態，大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關。
（二）生長增殖
腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2％～5％）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發生轉化後，出現能在低血清培養基中生長的現象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養中發生惡性轉化後的單個細胞培養時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發展，形成堆積物。
（三）永生性
永生性也稱不死性。在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀，體內腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主並同歸於盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細胞系或株的過程說明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應易於培養。事實上，多數腫瘤細胞初代培養時並不那麼容易。生長增殖並不旺盛；經過純化成單一化瘤細胞後，也大多增殖若干代後，便出現類似二倍體細胞培養中的停滯期。過此階段後才獲得永生性，順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養後獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。
（四）浸潤性
浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時，能浸潤入其它組織細胞中，並有穿透人工隔膜生長的能力。
（五）異質性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處於瘤體周邊區的細胞獲得血液供應多，增殖旺盛，中心區有的細胞衰老退化，有的處於周期阻滯狀態，那些呈活躍增殖狀態的細胞稱幹細胞（Stem Cells）、只有這些幹細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤幹細胞培養時易於生長增殖；把幹細胞分離出來的培養方法稱幹細胞培養。
（六）細胞遺傳
大多數腫瘤細胞有遺傳學改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個細胞群組成，有幹細胞系和數個亞系，並不斷進行著適應性演變。
（七）其它
腫瘤細胞在體外不易生長的原因可能由於：①依賴性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質成纖維細胞的依賴。體外分散培養和排除成纖維細胞後也會同時消除或減弱這些依存關系，可能影響癌細胞增殖生長的活性；②腫瘤細胞的自泌也會因分散培養而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力；③並非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的Life Span，只有幹細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數量很少；④離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。
二、培養方法
腫瘤細胞培養成功關鍵在於：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養並無原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。 （一）要點
1．取材：
人腫瘤細胞來自外科手術或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材後宜盡快進行培養，如因故不能立即培養，可貯存於4℃中，但不宜栽過24小時。
2．培養基：
腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用於腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長，腫瘤細胞在低血清培養基中也能生長。腫瘤細胞對培養環境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產生促生長物質之故。但這並不說明腫瘤細胞完全不需要這些成分。按不同細胞需要不同的生長因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細胞等）。總之培養腫瘤細胞仍需加血清和相關生長因子培養更易成功。
3．成纖維細胞的排除：
成纖維細胞常與腫瘤細胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關鍵。排除成纖維細胞有多種方法（表2－1）。

（二）成纖維細胞排除法
1．機械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉製成，裝入試管中高壓滅菌後備用（也可用特製電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養液繼續培養，如發現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止
2．反復貼壁法：
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，並結合使用不加血清的營養液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長達一定數量後，倒出舊培養液，用胰酶消化後，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打製成細胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5～20分鍾後，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角後慢慢吸出全部培養液，再接種入B培養瓶中後；向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；
（4）培養B瓶中細胞5～20分鍾後，接處理A的方法，把培養液注入C培養瓶中；再向B瓶中補加完全培養基。
當三個瓶內都含有培養液後，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。
3．消化排除法：
此法曾用於乳癌細胞的培養，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然後再換成新的混合液繼續消化，並在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養瓶，到半數細胞脫落下來後，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶內也補加新的培養液繼續培養。用此法處理後，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經過幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。
4．膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發現成纖維細胞被除掉後，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次後，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。
5．其它方法：
有人發現聚丙烯醯胺有抑製成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液後，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經過分離進行培養。最近也有人應用特殊化學物如SOD抑製成纖維細胞生長的方法。
選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
（三）提高腫瘤細胞培養存活率和生長率措施
根據人們的經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養後，常出現以下幾種情況：
完全無細胞游出或移動；
有細胞移動和游出，但無細胞增殖，細胞長時間處於停滯狀態以致難以傳代；
有細胞增殖，傳若干代後停止生長或衰退死亡；
傳數代後細胞增殖緩慢，經過一段停滯期後，才又呈旺盛生長狀態，形成穩定生長的腫瘤傳代細胞系。
以上現象說明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，並需經過對新環境的適應才能生長，因此欲獲得好的培養效果，不能局限於一般培養法，必須採用一些特殊的措施。
1．適宜底物：
把經過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
2．生長因子：
應用促細胞生長因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長因子。根據細胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。
為提高腫瘤細胞對體外培養環境的適應力和增加有活力癌細胞（幹細胞）的數量，可採用動物體轉嫁接種成瘤後，再從動物體內取出進行培養，能提高體外培養的成功率。受體動物以裸鼠最好。
3.動物體媒介培養方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動物腹部後，直接刺入皮下，注入瘤塊；
（2）飼養觀察，待腫瘤生長達較大體積後，剝取出瘤組織；
（3）進行體外培養。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易於成功。
腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同，但成功率比正常細胞高。
（四）體外培養腫瘤細胞生物學檢測
一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系（或株）後，不論用於實驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學測定，主要的目的在於求得證明：
所培養的細胞系的確來源於原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。測定項目數量無明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點。
【形態觀察】主要觀察細胞的一般形態，如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。
【細胞生長增殖】檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。
【細胞核型分析】檢測核型特點，染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。
【異體動物接種】向異體動物體內（皮下）接種細胞懸液，觀察成瘤能力。
【其它】除上述項目外，根據需要還可做同位素標記、組織化學成分分析，熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細胞生物學檢測中，最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書第二篇中介紹。
（五）對腫瘤細胞系或細胞株的評價
已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無疑都是可用的實驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，並獲得越來越廣泛的應用。但根據研究者的經驗，在使用這些細胞系時，應持特別審慎態度，主要是應考慮到這些細胞在長期傳代中有否發生遺傳性改變的可能。眾所周知，長期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。另外也可能發生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產生生物學性狀上的變動。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則百代以上後，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時的性狀仍是一致的。已如前述，癌細胞在培養中並非能很順利地傳下去，凡已長期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在長期培養中的癌細胞的生物學性狀與體內時仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來說，應用各種較長時間培養細胞做實驗時，都應如此。

⑦ 去除纖維細胞後如何終止膠原酶消化

加點代血清的培養基。

⑧ 膠原酶的使用

1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊
2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。
3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。
消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。
4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

⑨ 細胞培養傳代時終止消化用什麼試劑

細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好
一、貼壁細胞的消化
:
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、
酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶
這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶
這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。
胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同cmf或pbs加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入pbs緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。

⑩ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.