鼠尾膠原怎麼成膠

⑴ 求助 細胞復甦後不活怎麼回事

細胞復甦後不活怎麼回事

齊氏生物認為復甦細胞是否貼壁跟你凍存時的操作有直接關系。而且細胞的傳代數越多，即細胞越老，越禁不起低溫的折騰。復甦後，細胞有個休眠期，大約7-14天不等。只要不死，你就慢慢養著。突破了某個時間點，你會發現細胞又神奇的康復了。但要等到細胞狀態良好，傳2代以上再做實驗。尤其是流式、RNA干擾之類的。

1. 細胞不好貼壁，細胞生物學專家CHI scientific 建議您嘗試以下6點：

2. 復甦後洗滌一下,畢竟DMSO影響細胞的生長。

3. 最好用塑料瓶培養,如果是玻璃瓶,那麼可以用鼠尾膠原包被一下培養瓶,或者用鹽酸對培養瓶進行蝕刻,效果應該還可以，或者塗 fibronectin/collagen /BSA，也可以幫助細胞貼附

還有就是你的凍存的細胞是否是完全死了,如果是的話是不可能貼壁的,因此在復甦後我建議你用台盼蘭染色看一下死細胞和活細胞的數目及比例.

4.換液時間延長，盡量不要用力搖動。

5.盡量縮短復甦時間

6.操作的環境溫度最好不要變動太多。

⑵ 求細胞遷移實驗步驟（Transwell或細胞劃痕法都可以）

細胞遷移實驗步驟（Neuroprobe的使用方法）

1．膜預處理
將48.5ml H2O +1.5ml 醋酸+150μL 鼠尾膠原置於50ml的離心管。在膜的粗糙面用鉛筆做標記，放入上述溶液中4度過夜。
實驗前將膜取出，放入裝有PBS的培養皿中漂洗一遍，再用飢餓培養基洗一遍，吸去培養基後加入新的飢餓培養基，放入37度培養箱中。
2. 處理細胞
將細胞消化，調濃度1×105個/ml，細胞遷移裝置下層加入166μl含有刺激因子的飢餓培養基。小心鋪好膜（粗面朝下），裝好塑料墊，固定上層裝置。上層加入100μl細胞懸液，遷移4-6h。
3. 固定
小心將膜取下來，在用PBS弄濕的濾紙上掛掉光滑面的細胞，在新的濾紙上粗面朝上放置，徹底晾乾。然後再甲醇里粗面朝上固定5min，徹底晾乾。
4. 染色
粗面朝下置於結晶紫染液中30min，取出膜用雙蒸水漂洗一遍，粗面朝上放在載玻片上，數細胞。
這個方法比transwell方便。與boyden chemper法類似。

Transwell法的步驟：
先把小室擦乾凈後在超凈工作台照紫外過夜。如新的小室省略此步。下一步將小室倒扣並小室的底部外側滴加0.1%（還是1%記不清了）的明膠室溫放置20-30分鍾。這是將細胞消化下來，調濃度。拿出24孔板加600ml的含有刺激因子的培養基。小室上還未乾的明膠甩掉，加細胞放入24孔板里。放入細胞培養箱培養4-6小室。拿出小室甩掉里邊的培養基。小心擦盡小室里邊的細胞（不能碰外邊）。將小室放入裝有600ml結晶紫的24孔板染色1小時。移到空的24孔板後即可在顯微鏡下觀察了。

⑶ huh7與和hepg2兩個細胞系的區別

huh7與和hepg2兩個細胞系的區別主要是：

1、來源不同

Huh7人肝癌細胞系是由Naka bayashi等人建立的，細胞源自一個日本男性高分化肝細胞肝癌；

HepG2來源於高加索地區一個15歲白人的肝癌組織。

2、類型不同

Huh7人肝癌細胞系是高分化肝細胞肝癌；

HepG2組織類型為肝母細胞瘤。

3、分泌物不同

Huh7人肝癌細胞系能產生一些細胞質蛋白，如白蛋白、a抗胰蛋白酶、AFP等。

HepG2細胞系可分泌ALB、a2-MG等，適合用於肝細胞代謝方面的研究。

(3)鼠尾膠原怎麼成膠擴展閱讀：

腫瘤細胞培養技術要點

1、取材

材料主要來源於外科手術或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉移淋巴結或胸腹水是較好的培養材料。取材後盡快培養，因故不能立即培養者，可凍存。其培養方法及凍存方法同前述正常組織。

2、成纖維細胞排除

在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞，培養時能與瘤細胞同時生長，並常壓過癌細胞，導致癌細胞生長受阻以至消失，應仔細排除。排除方法常有：機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

3、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率

根據實驗經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養後，要經過對新環境的適應才能生長，因此不能局限於一般培養法，須採用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養。

⑷ 原代肝細胞培養問題

原代肝細胞很容易貼壁生長，4小時肯定能貼壁。

「然後就有渾濁的沉澱，那個沉澱是肝細胞吧？」將此沉澱用培養液或pbs稀釋，加台盤藍染色，顯微鏡下觀察，若為活細胞，通常就是肝細胞了，要培養好，最好有大於85%以上的活性。

原代肝細胞最好生長在鼠尾膠原上，也就是用鼠尾膠原鋪板，然後再普細胞。

4小時後換液，然後每20小時左右換液，通常原代肝細胞難以增值，但是維持20天左右沒問題。

⑸ 鼠尾膠原蛋白I型，用那一種膠原酶可以溶解

醋酸就可以.

1．將膠原加入到0.1M 的醋酸中，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解。

2．建議將溶液轉移到擰口的玻璃瓶中，並小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%。不要晃動或攪拌。在2-8度中放置過夜。在無菌條件下轉移上層的膠原溶液。我們不建議用過濾的方法無菌化。已經發現該方法會導致丟失蛋白。

3．稀釋一定數量的膠原溶液。

4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養瓶。在室溫或37度結合數小時或者2-8度過夜。

5．從包被表面除去多餘的液體。過夜乾燥。如果膠原溶液不是無菌的，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒。 在接種細胞前用無菌的水漂洗。

⑹ 細胞系的建株要點

腫瘤細胞培養技術要點
1、取材：材料主要來源於外科手術或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位，瘤性轉移淋巴結或胸腹水是較好的培養材料。取材後盡快培養，因故不能立即培養者，可凍存。其培養方法及凍存方法同前述正常組織。
2、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞，培養時能與瘤細胞同時生長，並常壓過癌細胞，導致癌細胞生長受阻以至消失，應仔細排除。排除方法常有：機械刮除法、反復貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。3、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率
根據實驗經驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養後，要經過對新環境的適應才能生長，因此不能局限於一般培養法，須採用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子，根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子，如胰島素、氫化可的松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養。

⑺ transwell細胞成團怎麼回事

染色
粗面朝下置於結晶紫染液中30min。小心鋪好膜（粗面朝下）。
4。然後再甲醇里粗面朝上固定5min，徹底晾乾，在新的濾紙上粗面朝上放置，徹底晾乾。拿出小室甩掉里邊的培養基。小心擦盡小室里邊的細胞（不能碰外邊）細胞遷移實驗步驟（Neuroprobe的使用方法）

1．膜預處理
將48.5ml H2O +1。移到空的24孔板後即可在顯微鏡下觀察了.5ml 醋酸+150μL 鼠尾膠原置於50ml的離心管，裝好塑料墊. 固定
小心將膜取下來。這是將細胞消化下來。將小室放入裝有600ml結晶紫的24孔板染色1小時，調濃度。拿出24孔板加600ml的含有刺激因子的培養基。
3，加細胞放入24孔板里。放入細胞培養箱培養4-6小室。在膜的粗糙面用鉛筆做標記，放入上述溶液中4度過夜。
實驗前將膜取出，放入裝有PBS的培養皿中漂洗一遍，再用飢餓培養基洗一遍，吸去培養基後加入新的飢餓培養基，放入37度培養箱中。
2. 處理細胞
將細胞消化，調濃度1×105個/ml。與boyden chemper法類似。

Transwell法的步驟：
先把小室擦乾凈後在超凈工作台照紫外過夜。如新的小室省略此步。下一步將小室倒扣並小室的底部外側滴加0.1%（還是1%記不清了）的明膠室溫放置20-30分鍾，細胞遷移裝置下層加入166μl含有刺激因子的飢餓培養基，粗面朝上放在載玻片上，數細胞。
這個方法比transwell方便，取出膜用雙蒸水漂洗一遍，固定上層裝置。上層加入100μl細胞懸液，遷移4-6h。小室上還未乾的明膠甩掉，在用PBS弄濕的濾紙上掛掉光滑面的細胞

⑻ 有哪位高手能詳細指導一下用transwell板做細胞趨化實驗的具體方法和步驟嗎

1
材料與方法
1.
1
Matrigel：Becton
Dickinson
Compary,
-
20
℃保存；
Tanswell
plate：Costar
,USA
,
#
3422
,聚碳酯膜微孔直徑為8μm；
蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1.
2
趨化因子的制備
取傳代第二天長勢良好的NIH3T3細胞,無血清培養基輕柔漂洗兩次;
加入無血清培養基,37℃,5
%CO2
培養24
h～48h，收集細胞培養上清；4
℃,12
000rpm
離心,10
min
,取上清；0.22
μm
濾膜過濾除菌；分裝,在-
20
℃保存。
1.
3
transwell
培養板准備
所有操作均需無菌操作。-20℃保存的Matrigel
在冰上保2℃～8℃過夜融化。在冰上用預冷的槍頭吸取100μl
Matrigel
加入冰預冷的300μl
無血清培養基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel
25
μl
加入transwell
板上室,覆蓋整個聚碳酯膜,37
℃,30
min
,使Matrigel
聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell
培養板置於37℃可保存2
周。
1.
4
Matrigel
侵襲實驗(Matrigel
Invasion
Assay)刺激後的各組細胞用PBS
漂洗3
次。以常規方法用無血清培養基制備單細胞懸液,5
×105個細胞/
ml
,每組細胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實驗,細胞活力需大於95
%。Transwell
培養板上室加入100μl
細胞懸液(
5
×104
個)
並加入無血清培養基200
ul
。Transwell
培養板下室加入500μl
趨化因子,37℃,5
%CO2
培養24
h。用濕棉簽輕輕擦去Matrigel
凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞。小心取出上室,用線拴住,並做好標記,用冰預冷的甲醇固定30
min。蘇木素染色1
min。梯度乙醇脫水(80
%
,95
%
,100
%)
,二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片。附著於聚碳酯膜下表面的細胞在高倍鏡下(
×400)
隨機取6
個視野[1
]
計數,取平均數。重復實驗兩次。
注意
2.
1
NIH3T3
細胞制備的趨化因子與胎牛血清
趨化因子是能使細胞產生趨化運動的一類細胞因子[2
]
。目前利用NIH3T3
細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗的實驗室比較多,時間較長且實驗步驟繁瑣。眾所周知,胎牛血清中有趨化因子,我們在不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810
膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗中發現用胎牛血清和用NIH3T3
細胞制備的趨化因子做細胞體外侵襲實驗效果是一樣的,兩組遷移的細胞數很接近。在實驗時間上，用NIH3
T3細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為1
周,而用胎牛血清作趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為2
d
,實驗時間節省了很多。因此認為可以用胎牛血清來代替NIH3T3
細胞制備的趨化因子。
2.
2
細胞的准備
所需細胞應處在對數生長期,細胞活力需大於95
%。如果細胞活力小,就會造成細胞穿透能力下降,影響實驗結果。
2.
3
擦去Matrigel
凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞
先用干棉簽將上室內液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat
rigel
凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞,如果沒有擦凈聚碳酯膜上表面的細胞,在細胞計數時就會將沒擦掉的細胞也計進來。尤其是細胞為圓形的時候,就會分辨不出是穿過去的細胞還是沒穿過去的細胞,對於長梭形細胞來說,穿過去的細胞為長梭形,沒穿過去的細胞多為圓形。
2.
4
蘇木素染色
上室浸泡在新蘇木素中的時間為1
min
,用過多次的蘇木素為2
min。在研究粉防己鹼對HUVEC
人類臍靜脈內皮細胞遷移能力的抑製作用沒有將多餘蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細胞圖片背景模糊,細胞不清楚(見圖1)
。在作不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810
膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗時我們將其置於盛有自來水的燒杯中,反復漂洗幾次,將多餘蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細胞圖片背景干凈,細胞清楚(見圖2)
。

⑼ 求助原代肝細胞培養問題

原代肝細胞很容易貼壁生長,4小時肯定能貼壁.
「然後就有渾濁的沉澱,那個沉澱是肝細胞吧?」將此沉澱用培養液或pbs稀釋,加台盤藍染色,顯微鏡下觀察,若為活細胞,通常就是肝細胞了,要培養好,最好有大於85%以上的活性.
原代肝細胞最好生長在鼠尾膠原上,也就是用鼠尾膠原鋪板,然後再普細胞.
4小時後換液,然後每20小時左右換液,通常原代肝細胞難以增值,但是維持20天左右沒問題.

⑽ 復甦的細胞為什麼不貼壁

齊氏生物認為復甦細胞是否貼壁跟你凍存時的操作有直接關系。而且細胞的傳代數越多，即細胞越老，越禁不起低溫的折騰。復甦後，細胞有個休眠期，大約7-14天不等。只要不死，你就慢慢養著。突破了某個時間點，你會發現細胞又神奇的康復了。但要等到細胞狀態良好，傳2代以上再做實驗。尤其是流式、RNA干擾之類的。
細胞不好貼壁，細胞生物學專家CHI
scientific
建議您嘗試以下6點：
復甦後洗滌一下,畢竟DMSO影響細胞的生長。
最好用塑料瓶培養,如果是玻璃瓶,那麼可以用鼠尾膠原包被一下培養瓶,或者用鹽酸對培養瓶進行蝕刻,效果應該還可以，或者塗
fibronectin/collagen
/BSA，也可以幫助細胞貼附

還有就是你的凍存的細胞是否是完全死了,如果是的話是不可能貼壁的,因此在復甦後我建議你用台盼蘭染色看一下死細胞和活細胞的數目及比例.

4.換液時間延長，盡量不要用力搖動。
5.盡量縮短復甦時間
6.操作的環境溫度最好不要變動太多。

希望能幫到你！